質(zhì)粒電轉(zhuǎn)整合穩(wěn)定細(xì)胞株
▏ 名詞定義
電穿孔，也稱為電通透化，是一種高效的非病毒遞送系統(tǒng)，可使遺傳物質(zhì)（DNA和RNA）、蛋白質(zhì)、藥物或其他分子進(jìn)入細(xì)胞。它利用精確的脈沖電流在細(xì)胞膜上制造臨時(shí)孔隙，使分子能夠通過(guò)。
一旦質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞，就可能作用于細(xì)胞。遺傳物質(zhì)可能保持獨(dú)立（以質(zhì)粒的形式，未整合），也可能根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟整合到宿主基因組中。
▏ 工作原理
體外電穿孔時(shí)，將靶細(xì)胞懸浮液與待導(dǎo)入細(xì)胞的質(zhì)粒DNA在導(dǎo)電溶液中混合，然后放入比色皿中（圖1）。電穿孔比色皿的樣品室兩側(cè)各有一塊金屬板，電流可以通過(guò)混合物。將比色皿放入電穿孔儀的腔室中，該腔室配有相應(yīng)的電觸點(diǎn)，使比色皿形成電路。電穿孔儀上的控制器允許用戶設(shè)置待輸送電脈沖的電壓、波形和持續(xù)時(shí)間，這些參數(shù)應(yīng)根據(jù)靶細(xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化。然后，電脈沖通過(guò)樣品室。
圖 1：裝有比色皿的電穿孔儀主要部件示意圖。圖片來(lái)源：Richard Wheeler
電脈沖擾亂細(xì)胞膜的磷脂雙層，從而形成孔隙（圖 2）。這種過(guò)程是不對(duì)稱的，孔隙首先在細(xì)胞的陽(yáng)極側(cè)形成。同時(shí)，跨膜電位增加。這驅(qū)使帶電分子（例如質(zhì)粒DNA）首先吸附到細(xì)胞陰極側(cè)的膜上，然后穿過(guò)這些孔隙進(jìn)入細(xì)胞 （圖 3）。
圖2：電穿孔過(guò)程中細(xì)胞膜破壞和孔隙形成的示意圖。圖片來(lái)源：Technology Networks。
▏ 優(yōu)缺點(diǎn)
|
優(yōu)點(diǎn) |
缺點(diǎn) |
|
操作相對(duì)簡(jiǎn)單 |
需要專用儀器 |
|
對(duì)轉(zhuǎn)染難度較大的細(xì)胞類型效果良好 |
參數(shù)必須經(jīng)過(guò)仔細(xì)優(yōu)化 |
|
無(wú)載體要求，甚至不需要載體 |
對(duì)細(xì)胞損傷較大，部分無(wú)法恢復(fù)而死亡 |
|
對(duì)細(xì)胞類型的依賴性小 |
/ |
|
快遞轉(zhuǎn)染大量細(xì)胞，相對(duì)成本低 |
/ |
|
可以轉(zhuǎn)染含有細(xì)胞壁的物種 |
/ |
▏ 關(guān)鍵參數(shù)
制定電穿孔方案時(shí)，重要的是選擇合適的參數(shù)，使其能夠?qū)崿F(xiàn)通透性，同時(shí)最大程度地減少對(duì)細(xì)胞膜的干擾，以最大限度地提高細(xì)胞活力、實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性和效率。需要考慮的因素包括：
1. 波形：指數(shù)衰減脈沖、方波脈沖
方波脈沖迅速上升到設(shè)定電壓，維持該水平，然后在脈沖結(jié)束時(shí)迅速截止；指數(shù)衰減波的電壓迅速上升到目標(biāo)值，然后隨時(shí)間下降。一般而言，哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染選擇方波脈沖比較多；
2. 脈沖時(shí)間：針對(duì)方波脈沖，一般是直接設(shè)置持續(xù)時(shí)間；指數(shù)衰減脈沖會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)，電壓逐漸降低，一般用時(shí)間常數(shù)TC表示，需要結(jié)合對(duì)細(xì)胞的損傷來(lái)優(yōu)化；
3. 場(chǎng)強(qiáng)：指施加于電極間隙的電壓，這個(gè)電壓跟很多因素有關(guān)，比如比色皿的間隙、細(xì)胞的大小、溫度等。
4. 緩沖液：緩沖液的電阻、鹽濃度、緩存能力都會(huì)影響電轉(zhuǎn)效果，比如有些敏感細(xì)胞更喜歡培養(yǎng)基組份；
5. 溫度：高功率一般傾向于低溫，比如冰上操作；
6. pH變化：電極電解可能引起pH變化，可以通過(guò)緩沖液調(diào)整；
7. 細(xì)胞數(shù)量：細(xì)胞過(guò)密會(huì)導(dǎo)致電弧放電，過(guò)稀會(huì)降低陽(yáng)性比率；
8. 細(xì)胞質(zhì)量：因?yàn)殡娹D(zhuǎn)本身對(duì)細(xì)胞有損傷，因此被電轉(zhuǎn)的細(xì)胞質(zhì)量尤為重要，一般是選擇健康、無(wú)污染、分裂活躍、代數(shù)低的細(xì)胞；
9. 質(zhì)粒質(zhì)量：質(zhì)量差或者污染的質(zhì)粒DNA會(huì)降低電轉(zhuǎn)效率；
其他：比色皿表面的水份、高鹽、氣泡等，都可以引起電弧放電。
▏ 瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定整合
▏ 應(yīng)用場(chǎng)景
1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，追求瞬間高拷貝/超拷貝的蛋白表達(dá)； 2 穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建，生物安全等級(jí)低，對(duì)整和效率、整合位置要求不高。
▏ 穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)
科佰生物提供“質(zhì)粒電轉(zhuǎn)整合系統(tǒng)”穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)，利用該系統(tǒng)，我們已經(jīng)成功構(gòu)建超過(guò)300株穩(wěn)定細(xì)胞株的模型，有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，歡迎溝通咨詢。
|
|
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 |
病毒感染 |
Flp-FRT系統(tǒng) |
轉(zhuǎn)座子系統(tǒng) |
基因編輯 |
||
|
|
脂質(zhì)體 |
電轉(zhuǎn) |
慢病毒 |
||||
|
適用細(xì)胞 |
部分細(xì)胞 |
幾乎所有細(xì)胞 |
幾乎所有細(xì)胞 |
內(nèi)部4種細(xì)胞 |
幾乎所有細(xì)胞 |
部分細(xì)胞 |
|
|
轉(zhuǎn)染/感染效率 |
低 |
中 |
高 |
高 |
高 |
低 |
|
|
隨機(jī)整合 |
是 |
是 |
是 |
否 |
- |
否 |
|
|
生物安全等級(jí) |
BL1 |
BL1 |
BL2 |
BL1 |
BL1 |
BL1 |
|
|
基因裝載能力 |
- |
- |
<4-5k |
- |
- |
- |
|
|
陽(yáng)性率 |
低 |
高 |
高 |
高 |
高 |
低 |
|
|
周期 |
基因合成 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
|
病毒包裝 |
- |
- |
1周 |
- |
- |
- |
|
|
混合克隆篩選 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
|
|
單克隆篩選 |
>3 周 |
>3 周 |
>3 周 |
可選 |
可選 |
>3 周 |
|
|
合計(jì) |
> 8-10 周 |
> 8-10 周 |
>9-11周 |
5-7 周 |
5-7 周 |
> 8-10 周 |
|
|
工作負(fù)荷 |
高 |
中 |
中 |
低 |
低 |
高 |
|
